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【特马王中王一码一肖】单链DNA介导的人为限制

2019-08-16 04:36

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核心提示:限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA,而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶,它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用,它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列,有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段;有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3' 3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5' DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后,用等体积酚/氯仿抽提,加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇,混匀后置-70℃低温冰箱30分钟,离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。 DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱,它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成,以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中,建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节,近年来发展起来的RFLP技术更是建立在它的基础上。 构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶,通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。 在酶切图谱制作过程中,为了获得条带清晰的电泳图谱,一般DNA用量约为0.5-1μg。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度。对质粒DNA酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶,消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2-3倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。注:酶切的选择原则一般是尽量扩大酶切体系,这样抑制因素得以稀释;基因组DNA或质粒DNA酶的用量较一般DNA大,一般为1μg/10U;所加酶的体积不能超过酶切总体积的1/10,否则甘油浓度会超过5%,会产生星号活力;对难切的质粒或基因组DNA应延长反应时间4—5hr, 甚至过夜。灭火限制性内切酶活性可以采用加热灭活,乙醇沉淀,酚/氯仿抽提,添加EDTA或SDS等方法,具体每一种酶可能有些方法不能完全灭活,这一点需要注意。阅读全文

限制性内切酶是一识别DNA序列并在识别序列或识别序列附近进行切割的细菌蛋白。大多数限制性内切酶如II型限制酶,只能识别较短的DNA序列,这大大限制了这种酶在DNA重组技术中的应用。为了克解决以上难题,已有相关蛋白质工程研究工作被报道,如通过将DNA结合域与核酸酶域(锌指头结合蛋白ZFNs或类转录激活子核酸酶TALENs)融合而成的人工限制性内切酶(Artificial restriction enzymes, AREs);或在体外利用CRISPR-Cas9系统设计的AREs。这些已报道的AREs具有比天然存在的限制酶更高的特异性,但它们切割DNA之后并不能生成明确的黏性末端或平末端,并且这类AREs的活力不高。基于这些因素,限制了已报到的AREs在体外的应用。

Argonaute是一类可结合在短的核苷酸序列上的蛋白,它在所有生物中都很保守。在真核生物中,Argonaute蛋白参与了RNA沉默或者RNA向导的RNA切割;而在原核中,Argonaute蛋白可以在短的DNA序列的引导下切割ssDNA或ssRNA。而近期,来自伊利诺伊大学的研究人员,借助来自古细菌Pyrococcus f uriosus里的Argonaute,以5’端磷酸化的ssDNA为向导,实现了分子克隆和DNA fingerprinting。据研究人员介绍,PfAgo能够切割靶定DNA序列形成明确的黏性末端,在切割过程中,先将PfAgo、ssDNA及线性双链DNA孵育在87-98 °C高温环境下,PfAgo在ssDNA引导下结合和切割退火后的单链模板;然后再将孵育温度降低,让切割后的DNA退火形成具有明确黏性末端的双链DNA。小编认为,pfAgo介导的体外切割,从操作上来讲,向导RNA为单链DNA,可直接合成,相比于Cas9系统的向导RNA,ssDNA的获得更为方便且稳定;另外,PfAgo介导的切割或可用于大片段的捕获,将基因组与pfAgo、ssDNA混合,然后根据文章所所报道的步骤进行定点切割,进而捞取我们所想要的大片段。

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